Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis, zur Speziesdifferenzierung und zur Serotypisierung von Cronobacter sakazakii

von Mara Benecke

158 Seiten, Taschenbuch

Kurzbeschreibung des Verlags

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Cronobacter sakazakii in getrockneter Säuglingsanfangsnahrung.

Zur Gewinnung polyklonaler Antikörper wurden zwei Immunisierungen von Kaninchen durchgeführt. Das verwendete Immunreagenz setzte sich aus jeweils drei verschiedenen Cronobacter sakazakii-Isolaten zusammen, welche mittels Paraformaldehyd (PFA) inaktiviert wurden. Für die erste Immunisierung wurde ein Gemisch aus drei Isolaten verschiedenen Serotyps (O1, O3, O7) verwendet, die zweite Immunisierung bestand aus einem Gemisch aus Isolaten des Serotyps O2. Die Immunantwort wurde unter Verwendung eines kompetitiven direkten Enzymimmuntest untersucht.

Die gewonnen Antiseren wurden mittels Ammoniumsulfat gefällt und ein Anteil anschließend biotinyliert. Unter Verwendung des gefällten Antiserums als Fängerantikörper und des gefällten und biotinylierten Antiserums als Detektionsantikörper wurden zwei Sandwich-Enzymimmuntests (Testsystem Cronobacter1 und Cronobacter2) entwickelt.

Zur Ermittlung der Testspezifität wurden 296 verschiedene Bakterien unter den Bedingungen der Enzymimmuntests untersucht und die Erfassbarkeit sowie mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Cronobacter spp. und verwandten Bakterienstämmen getestet. Beide Sandwich-EIA erfassten zusammen 73% der Cronobacter sakazakii-Isolate, es wurden keine Kreuzreaktionen mit anderen Cronobacter spp. oder verwandten Bakterien festgestellt. Die Nachweisgrenzen variierten für Isolate der verschiedenen Serotypen zwischen 103 und 105 KbE/ml. Nach standardmäßiger Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser bei 37 °C für 18+/-2 Stunden und Einsatz von unverdünnter Bouillon, erzielten die positiven Isolate stets deutliche Farbreaktionen. Die Durchführung des Nachweisverfahrens dauerte in unseren Versuchen 21 bis maximal 24 Stunden, inklusive der Voranreicherung.

Es wurden 79 Isolate von Cronobacter sakazakii durch Multiplex-PCR nach der Methode von SUN et al. (2012) serotypisiert und die Ergebnisse mit den Ergebnissen der Sandwich-EIA verglichen. Das Testsystem Cronobacter1 zeigte eine spezifische Erfassung aller Isolate des Serotyps O1 und etwa die Hälfte der Isolate der Serotypen O3 und O7. Die Referenzkurven zeigten deutlich unterschiedliche Dosis-Wirkungsbeziehungen für die Isolate verschiedener Serotypen. Das Testsystem Cronobacter2 reagierte hochspezifisch mit allen Isolaten des Serotyps O2. Beide Testsysteme zeigten keine Kreuzreaktionen mit Cronobacter sakazakii-Isolaten anderer Serotypen.

Für die Überprüfung des Einflusses der Probenmatrix auf die Testsysteme wurden Realproben getrockneter Säuglingsanfangsnahrung künstlich kontaminiert. In Anlehnung an den Untersuchungsgang nach ISO/TS 22964:2006 wurden die Proben in sterilem, gepufferten Peptonwasser gelöst, mit 1-10 KbE verschiedener Cronobacter sakazakii-Isolate künstlich kontaminiert und inkubiert. Die Probenmatrix zeigte keinen Einfluss auf die Testsysteme und für keimfreie und künstlich kontaminierte Proben konnte eine 100%ige Übereinstimmung der kulturell-mikrobiologischen Referenzverfahren und der entwickelten enzymimmunologischen Testsysteme erzielt werden.

• Reihe: Edition Scientifique
• ISBN: 9783835972582
• Erscheinungsdatum: 18.09.2025
• Genre: Medizin/Veterinärmedizin
• Verlag: VVB Laufersweiler Verlag