Molecular aspects of Besnoitia besnoiti-driven bovine neutrophil extracellular trap formation

von Gabriel Rodolfo Espinosa Espinoza

142 Seiten, Taschenbuch

Kurzbeschreibung des Verlags

Studien der letzten Jahre haben unser Verständnis der bovinen neutrophilen Reaktionen auf Besnoitia besnoiti, einen apikomplexen Parasiten und Erreger der wiederaufkommenden Rinderkrankheit Bovine Besnoitiose, wesentlich, jedoch nicht abschließend erweitert. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stand die Aufklärung bestimmter molekularer Mechanismen, die der Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs), einer zentralen Abwehrstrategie des angeborenen Immunsystems, zugrunde liegen. Entsprechend wurde zum einen die Rolle der purinergen Signalübertragung analysiert und gezeigt, dass Tachyzoiten von B. besnoiti eine starke NETs-Bildung in bovinen polymorphkernigen neutrophile Granulozyten (PMN) induzieren, ohne allerdings die intra- oder extrazellulären ATP-Konzentrationen zu verändern. Dennoch führte die extrazelluläre Zugabe von ATPγS, einem nicht- hydrolysierbaren ATP-Analogon, zu einer signifikanten Verstärkung der NETs-Freisetzung – insbesondere von verankerten NETs –, während natives ATP keinen solchen Effekt zeigte. Dieser Prozess erwies sich als abhängig vom purinergen Rezeptor P2X1, da der spezifische Antagonist NF449 (IC50 = 1,27 μM) sowohl die NET-Bildung als auch die auffällige PMN- Clusterbildung nach Tachyzoitenexposition hemmte. Im Gegensatz dazu hatte die pharmakologische Blockade anderer purinerger Rezeptoren (P2Y2, P2Y6, P2X4, P2X7) keinen Einfluss auf die parasiten-induzierte NETose, was auf eine selektive Rolle des P2X1- Rezeptors hinwies. Weiterführende Stoffwechselanalysen mittels Seahorse-Technologie zeigten eine erhöhte Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in PMN nach Exposition gegenüber Tachyzoiten, während ATPγS die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) steigerte, was auf eine mitochondriale Beteiligung bzw. metabolische Anpassung während der frühen Phase der NETose hindeutet. Eine zweite Studie ergänzte die oben genannten Befunde, indem sie sich auf die Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase-Kinase 2 (CAMKK)/AMPK-Signalkaskade und deren Verbindung zur Autophagie konzentrierte. Die Exposition boviner PMN gegenüber B. besnoiti- und Toxoplasma gondii-Tachyzoiten führte innerhalb von 30 Minuten zu einer schnellen Phosphorylierung von AMPK, was auch durch Behandlungen mit dem AMPK- Aktivator AICAR nachgeahmt wurde. Im Hinblick auf die Signaltransduktion korrelierte die AMPK-Phosphorylierung mit der Aktivierung des Upstream-Regulators CAMKK in B. besnoiti- und T. gondii-exponierten PMN sowie mit der Hochregulierung des autophagieassoziierten Proteins ULK-1 (aber nicht Beclin-1) im Fall von B. besnoiti- exponierten PMN, was auf eine selektive autophagische Signatur hinweist. Bemerkenswerterweise führten AICAR-Behandlungen allein zu einer verstärkten NETs- Bildung, ohne die Lebensfähigkeit der PMN zu beeinträchtigen. In B. besnoiti-exponierten PMN zeigten AICAR-Kombinationsbehandlungen jedoch keinen Einfluss auf die oxidative Antwort. Darüber hinaus induzierten AICAR-Kombinationsbehandlungen additive Effekte auf die durch Tachyzoiten ausgelöste NETs-Bildung. Im Fall von T. gondii war diese NETs- Reaktion zusätzlich abhängig von MAPK- und Store-operated calcium entry (SOCE)- Signalwegen, was durch eine verminderte DNA-Freisetzung nach Inhibition von MAPK und SOCE bestätigt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Autophagie und AMPK- Signale parallele, ROS-unabhängige Signalwege darstellen, die die durch B. besnoiti induzierte NETs-Bildung unterstützen. Eine dritte Untersuchungsreihe widmete sich der Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) als potenzielle Modulatoren neutrophiler Reaktionen. Für die Experimente wurden EVs unterschiedlicher Quellen analysiert. Entsprechend wurden EVs aus Überständen von B. besnoiti-Tachyzoiten, von B. besnoiti-infizierten und nicht-infizierten bovinen Nabelvenen- Endothelzellen (BUVEC) sowie von Tachyzoiten-exponierten PMN gewonnen. Ihre Identität wurde über Nano-Flow-Zytometrie, die Detektion der EV-Marker CD9 und CD81 sowie durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Exposition boviner PMN mit diesen EVs, insbesondere jenen von Tachyzoiten und infizierten BUVEC, führte zu einer signifikanten NET-Freisetzung. Mikroskopisch konnte diese durch die Anwesenheit extrazellulärer DNA- Strukturen mit Histonen und neutrophiler Elastase – typische Merkmale klassischer NETs – bestätigt werden. Interessanterweise induzierten EVs von PMN selbst keine NETose, und keiner der EV-Typen veränderte das metabolische Profil (oxidative und glykolytische Reaktionen) oder die ROS-Produktion der exponierten Zellen, wie durch Seahorse-Analysen bzw. Chemilumineszenz-Assays gezeigt wurde. Dies weist auf einen NADPH-Oxidase (NOX)-unabhängigen Mechanismus der EV-induzierten NET-Bildung hin. Darüber hinaus zeigten Zytokinanalysen (IL-6 und IL-1β), dass EVs von B. besnoiti-infizierten BUVECs selektiv die Sekretion von IL-1β und IL-6 in PMN erhöhten, ohne die Produktion von CXCL8 zu beeinflussen und lieferten darüber einen Hinweis auf eine gezielte, zellursprungsabhängige Entzündungsantwort.

• Reihe: Edition Scientifique
• Themen: Medizin Tiermedizin Allgemein Forschung
• ISBN: 9783835972735
• Sprache: Englisch
• Erscheinungsdatum: 25.03.2026
• Größe: 21 x 14.8 cm
• Verlag: VVB Laufersweiler Verlag