Konventionelle und computergestützte Auswertung von Vaginalabstrichen bei der Hündin

von Felix Reckers

106 Seiten, Taschenbuch

Kurzbeschreibung des Verlags

"Expression von VIM, TPI und MAT2A und deren Einfluss auf die In-vitro-Angiogenese von humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen" Als Angiogenese wird der dynamische Prozess bezeichnet, der zur Neubildung von Blutgefäßen aus bereits existierenden führt. Die sprossende Angiogenese vollzieht sich durch die Migration der Tip cells, die Proliferation von Stalk cells und die Maturation von Phalanx cells. In Rahmen der Angiogenese-Forschung kommen In-vitro-Modelle regelmäßig zum Einsatz. Sie haben jedoch häufig Probleme bezüglich ihrer Reproduzierbarkeit. Mit der Entwicklung und dem Einsatz eines all-in-one assays, wurden Unterschiede bezüglich der angiogenen Potenz von Endothelzellen (ECs) festgestellt, die eine Klassifizierung in angiogene und nicht-angiogene ECs zur Folge hatten. Eine Proteomanalyse beider Gruppen zeigte, dass das Protein Adenosylmethionine-Synthetase Isoform Typ 2 (MAT2A) ausschließlich in nicht-angiogenen ECs exprimiert wurde. Dieses Enzym weist vor allem regulatorische Funktionen auf und hat vermutlich einen anti-angiogenen Effekt auf ECs. Die Proteine Vimentin (VIM) und Triosphosphate Isomerase (TPI) wurden nur in angiogenen ECs gefunden. Deshalb wurde vermutet, dass sie pro-angiogene Effekte auf ECs haben. VIM ist ein Typ III Intermediärfilament und beeinflusst Zellform und -motilität. TPI ist ein glykolytisches Enzym, welches Energie generiert und besonders die zelluläre Proliferation beeinflussen kann. Das Ziel beider Studien bestand darin, zu ermitteln, ob eine Verbindung zwischen der Expression von VIM, TPI und MAT2A und der In-vitro-Angiogenese in humanen dermalen mikrovaskularen ECs (HDMECs) besteht. Dafür wurden zwei Chargen an HDMECs unter Verwendung eines pro-angiogenen Mediums langzeit-kultiviert. Die Quantifizierung der In-vitro-Angiogenese erfolgte anhand phasenkontrastmikroskopischer Aufnahmen. Der Knockdown von VIM oder TPI wurde mittels lentiviralen Partikeln initiiert. Die mRNAExpression von Vascular endothelial growth factor 1 (VEGFR-1) und Vascular endothelial growth factor 2 (VEGFR-2) und die mRNA- und Proteinexpression von VIM, TPI und MAT2A mittels RT-qPCR und Western Blot wurde an Tag 1, 5, 15, 25 und 50 analysiert. In nativen Zellen zeigte sich die stärkste VIM-Expression hauptsächlich in den Stadien der Sprossung und Migration, die vermutlich durch VIM und dessen Einfluss auf das Zytoskelett angetrieben wurden. Während des Knockdowns von VIM, wurde ein starker Zelltod in Knockdown-Kulturen und eine Verzögerung der In-vitro-Angiogenese ermittelt. Dies führt zu der Vermutung, dass es sich bei VIM um ein für die Angiogenese essenzielles Protein handelt, das die angiogene Potenz steigert. Für TPI konnte in nativen Zellen ein allgemeiner Anstieg der Expression im Laufe der Kultivierung gezeigt werden. Da durch TPI den Zellen Energie zur Verfügung gestellt wird, ist es nachvollziehbar, dass TPI im Prozess der In-vitro-Angiogenese notwendig für die Stadien der Migration, Proliferation und Lumenbildung ist. Der TPI-Knockdown führte zu einer Verzögerung der In-vitro-Angiogenese, was vermuten lässt, dass TPI die angiogene Potenz vom ECs erhöht. Die konstante Expression vom TPI und der mit dem Abfall der TPI-Expression assoziiert Zelltod, lässt auf den essenziellen Charakter von TPI für das Überleben der Zellen schließen. Die native MAT2A-Expression war zu Beginn und am Ende der In-vitro-Angiogenese am stärksten. MAT2A besitzt vorwiegend regulierende Funktionen durch Methylierungen und ist dadurch vermutlich ein Protein, das besonders in ruhenden ECs exprimiert wird und an deren Maturation beteiligt ist. Beide Studien zeigten die Tendenz einer verringerten MAT2A-Expression in Verbindung mit einer geringeren angiogenen Potenz, welches die Vermutung unterstützt, dass MAT2A vornehmlich anti-angiogene Effekte auf HDMECs hat. Zusätzlich wurden beide Chargen anhand ihrer VEGFR-1 und VEGFR-2 Expression charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass HD1 eine höhere Anzahl an Stalk cells besaß, wodurch angenommen wird, dass HD1 eine höhere proliferative Kraft besitzt, welche zu einer höheren Zelldichte und zu höheren Werten bei der Quantifizierung der In-vitro-Angiogenese führte. Dies könnte auch der Grund dafür sein, dass in HD1 die VIM-Expression geringer und die TPI-Expression höher war als bei HD2. Darüber hinaus konnte in HD2 eine Beschleunigung der In-vitro-Angiogenese beobachtet werden, welche mit höheren MAT2A-Ct-Werten einherging. Des Weiteren zeigten Knockdown-Zellen von HD1 eine Erhöhung der Zelldichte und das Voranschreiten in höhere Stadien, wohingegen Knockdown-Zellen von HD2 entweder in einem frühen Stadium stagnierten oder zugrunde gingen. Zudem zeigte selbst die Kontrollgruppen von HD2 eine Verzögerung der In-vitro-Angiogenese, während die Kontrollgruppen von HD1 unbeeinflusst waren. Insgesamt wird deutlich, dass es für den Einsatz von ECs in In-vitro-Studien und die Interpretation von Forschungsergebnissen zwingend notwendig ist, Zellkulturen zu charakterisieren. Es ist angeraten, die Experimente unter Verwendung von Zellen unterschiedlicher Hersteller und unter Einsatz von nicht-angiogenen ECs zu wiederholen, eine weitere Nachweismethode zur Zellcharakterisierung hinzuzuziehen und eine Validierung der Proteineffekte mittels spezifischer Assays durchzuführen. Um die Ergebnisse auf das lebende System zu transferieren, sind Versuche notwendig, die mehr als eine Zellart aufweisen, gefolgt von In-vivo-Studien. Es ist angeraten einen MAT2A-Knockdown zu initiieren und weitere Proteine zu untersuchen, die potenziellen pro- oder anti-angiogenen Einfluss auf ECs haben. Des Weiteren sollten zukünftige Projekte auf die Entwicklung und Optimierung der Zellcharakterisierung abzielen, um die Reproduzierbarkeit und die Zuverlässigkeit von Studien im Bereich der In-vitro-Angiogenese zu verbessern.

• Themen: Medizin Tiermedizin Allgemein Forschung
• ISBN: 9783967292596
• Sprache: Englisch, Deutsch
• Erscheinungsdatum: 01.11.2024
• Größe: 21 x 14.8 cm
• Verlag: Mensch & Buch
• Herausgegeben von: Fachbereich Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin